Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли.
Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии. Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания предполагают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по Граму:
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты бумагу снимают, а краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.
Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:
- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);
- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).
Основные структуры.
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной стенки. Функции клеточной стенки:
Защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
Определение формы бактерий;
Участие в метаболизме бактерий.
Клеточная стенка пронизана порами, через которые происходит транспорт экзотоксинов бактерий. Толщина клеточной стенки составляет 10–100 нм. Основной компонент клеточной стенки бактерий - пептидогликан или муреин, состоящий из чередующихся остатков N-ацетил-N-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями.
В 1884 году Х. Грам предложил метод окраски бактерий с помощью генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Граму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм. В ней имеются тейхоевые кислоты (полимеры глицерина или рибита), а также в небольших количествах полисахариды, белки и липиды. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий многослойна, ее толщина составляет 14-17 нм. Внутренний слой (пептидогликан) образует тонкую непрерывную сетку. Внешний слой состоит из фосфолипидов, липопротеина и белков. Белки наружной мембраны прочно связаны с пептидогликановым слоем.
В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое количество углеводов.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
Барьерная функция (молекулярное “сито”);
Энергетическая;
Избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
Репликация и последующее разделение хромосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом .
Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.
Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.
Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.
Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
В цитоплазме прокариотов обнаруживаются различные включения, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, называемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.
Нуклеоид является ядром у прокариотов. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.
Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).
К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
Капсула - это слизистый слой над клеточной стенкой бактерии. Вещество капсул состоит из нитей полисахаридов. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.
Функции капсулы:
Место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;
Защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;
Способность прикрепления клеток к субстрату.
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:
- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .
К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.
У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспоры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
Центральное (возбудитель сибирской язвы);
Субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);
Терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).
Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
При простых методах окраски используется лишь одна краска.
С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.
При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.
1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной
стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по
Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и
грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых
бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических
включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности
– возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод
окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по
Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках
вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому,
используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод
окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в
зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
- Депарафинированные срезы доводят до воды.
- Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
- Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
- Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
- Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
- Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
- Промокают фильтровальной бумагой.
- Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
- Проводят через 3 смены ксилола.
- Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.
Окраска бактерий по по Цилю-Нильсену
Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.
Методика окраски:
| 1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров. | Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава. |
| 2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают. | |
| 3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. | Серная кислота-обесцвечивающий фактор. |
| 4. Промывают водой | |
| 5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут | Синька Леффлера - дополнительная краска |
| 6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией | Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора - синего цвета |
Окраска по по Ауески
Метод окраски спор бактерий, заключающийся в обработке препарата горячим 0,5% раствором соляной кислоты с последующей фиксацией и окраской по способу Циля - Нельсена; споры окрашиваются в рубиново-красный цвет, вегетативные формы - в синий.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-1.jpg" alt="> ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКОВ. МЕТОДЫ ОКРАСКИ. ">
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-2.jpg" alt="> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила"> Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии Правила работы со спиртовкой ØЗаправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля. ØПри зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т. к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта. ØНельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т. к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт. ØНельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком. ØНеобходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва. ØПри длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками. ØНе следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т. к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-3.jpg" alt="> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это"> Правила работы с живой культурой. 1. Главное при посеве живой культуры – это оградить посев от посторонних микробов и распространение культуры микроорганизма с питательной среды или материала во внешнюю среду. 2. Работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебания воздуха. 3. Во время посевов нельзя разговаривать, перемещаться по лаборатории. 4. Вся посуда и оборудование, подвергшиеся обсеменению во время работы с культурой, обрабатываются на месте путем фломбирования в пламени спиртовки или сброса в емкость с дез. средством. 5. По окончанию посевов рабочие поверхности столов подвергаются дезинфекции, обрабатываются руки. 6. Лабораторная посуда с посевами помещается в термостат: пробирки в штативе, а чашки Петри переворачивают дном вверх. Использование материалов и средств личной гигиены, раздражающих кожу рук, запрещается.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-4.jpg" alt="> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла"> Правила приготовления и хранения стекол (предметных, покровных). Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-5.jpg" alt="> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют"> Если стекла, вынутые через 2- 3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2- 5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20- 30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10- 15 мин в 5- 10% раствор хлористо-водородной кислоты и затем промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим способом: опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой; заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое кали или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в течение 30- 40
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-6.jpg" alt="> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3."> ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА. 1. Приготовление мазка 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-7.jpg" alt="> Рецепты приготовления красителей Карболовый"> Рецепты приготовления красителей Карболовый фуксин Циля: - насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл - раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон! Или - основной фуксин в порошке - 1 гр - карболовая кислота кристаллическая -5 гр - глицерин -0, 5 мл - спирт 96% - 10 мл - вода дистиллированная - 100 мл 2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные): - красителя - 1 гр - спирта 96% - 10 мл Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками. Фуксин Пфейффера: - фуксин Циля – 1 мл - воды дистиллированной – 9 мл Готовят непосредственно перед употреблением, т. к. раствор нестойкий. Бумага по Синеву: - 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового: на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-8.jpg" alt="> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ "> АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА ИЗ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА СКОШЕННОМ АГАРЕ(«КОСЯЧКЕ») Предметное стекло аккуратно берут за ребро и с обратной стороны нанесения мазка наносят его границы и номер культуры. Зажигают спиртовку, горелку, предварительно выпустив пары спирта. Фламбируют поверхность стекла, где будет располагаться мазок. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри В левую руку берут пробирку со стерильным физическим раствором (дистиллированной водой) и помещают между 1 и 2 пальцами таким образом, что ладонь находится под пробиркой и горлышко пробирки направлено в зону спиртовки В правую берут бактериальную петлю, как карандаш Петлю фламбируют до покраснения сначала горизонтально, затем вертикально Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку физ. р-ра к ладони и осторожно вынимают е из пробирки. Движения должны быть плавными Горло пробирки обжигают в пламени и вводят петлю Берут выпускной петлей физ. р-р и выносят на стекло пару капель в границы мазка Закрывают пробку, предварительно проведя через пламя спиртовки пробку и горло пробирки одновременно Ставят пробирку в штатив
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-9.jpg" alt="> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку"> В левую руку берут пробирку с культурой и помещают, как и пробирку с физ. р-ром петля в правой руке Петлю фламбируют Над пламенем спиртовки спокойно вынимают пробку с культуры одновременно обжигая пробку и горло пробирки Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки Петлю с культурой вносят в каплю физ. р-ра и осторожно эмульгируют, незаходя за границы мазка Бактериальную петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки Прожигают горло пробирки пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе либо высоко над пламенем спиртовки
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-10.jpg" alt="> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой"> Примечание: 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования физ. р-ра. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: отметить изолированную колонию со стороны дна чашки чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1 и 2 пальцами левой руки прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о крышку осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с физ. р-ром. При подсушивании мазка следует помнить: высокая температура может нарушить структуру клетки
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-11.jpg" alt=">Схема приготовления мазка ">
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-12.jpg" alt="> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический"> Виды фиксации q Физический – в пламени спиртовки. q Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова (1: 1 спирт и эфир) Цели фиксации Обеззараживание патогенных микробов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-13.jpg" alt="> Методы окраски: Простые Сложные (Грам, Циль-Нильсен, Ожешко, Бури - Гинс). ">
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-14.jpg" alt="> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые"> ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-15.jpg" alt=">При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного"> При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1- 2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10- 30 секунд, а метиленовой синькой – 2 -10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-16.jpg" alt=">При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и"> При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок. Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-17.jpg" alt="> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов"> СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ Основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-18.jpg" alt="> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет"> СПОСОБ ГРАМА v На фиксированный мазок нанести генцианвиолет (бумага по Синеву) на 1 -2 мин. v Краску слить и нанести раствор Люголя на 1 мин. v Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 мин в зависимости от толщины мазка. v Спирт смыть дистиллированной водой. v Мазок дополнительно окрасить разведенным фуксином Пфейффера на 2 -3 мин. v Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать с иммерсией Микроскопия с иммерсией. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-19.jpg" alt=">отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в"> отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8: 1 и 1: 1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-20.jpg" alt="> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ "> ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Грамположительные микроорганизмы Грамотрицательные микроорганизмы
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-21.jpg" alt=">Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+"> Стрептококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде цепочек Streptococcus piogenes Enterococcus faecalis Стафилококки Гр+ кокки, располагающиеся в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Бактерии Гр- палочковидные неспорообразующиие микроорганизмы Esherichia coli Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-22.jpg" alt="> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae "> Вибрионы Гр- Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Клостридии Гр+ ппалочковидные спорообразующие микроорганизмы. Диаметр спор больше поперечника клетки Clostridium perfringens Clostridium tetani Clostridium botulinum
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-23.jpg" alt="> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ "> ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ОСНОВАНИЕ: МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕЖДУНАРОДНОГО СОЮЗА БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ. ФРАНЦИЯ, ПАРИЖ, 1999 г Приготовление мазков Бактерии обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Захватите петлей материал и распределите тонким слоем на 2/3 части предметного стекла. Можно стекло с кусочком мокроты покрыть другим предметным стеклом, придавить друг к другу и раздавить в противоположном направлении до образования тонкого мазка. Можно для приготовления мазка пользоваться деревянными палочками. ВЫСУШИВАНИЕ Приготовленные мазки высушиваются на воздухе 15 -30 мин ФИКСАЦИЯ Медленно провести мазок в течение 3 -5 мин 3 раза через верхнюю или среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-24.jpg" alt=">ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин"> ОКРАШИВАНИЕ а) мазок накрыть фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги нанести карболовый фуксин Циля б) медленно нагревайте стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления паров, не допуская кипения и высушивания. Оставить мазок с прогретым раствором на 5 мин ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ а) снять фильтровальную бумагу и удалить окрашивающий раствор под слабой струей воды б) обработать каждый мазок индивидуально 25% раствором серной кислоты в течение 3 -х минут в) смыть водой г) обработать каждое стекло в течение 5 минут 96% спиртом д) смыть водой ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОКРАСКА Обесцвеченные и промытые стекла с мазками обработать 0, 3% раствором метиленовой синьки в течение 1 минуты Промыть водой и высушить на воздухе.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-25.jpg" alt="> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД)"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА (ИНСТРУКЦИЯ 1999 ГОД) На фиксированный препарат накладывают фильтровальную бумагу, на которую наносят карболовый фуксин Циля. Подогревают до отхождения паров, процедуру можно повторить. Выдерживают 5 мин 1. Н 2 О 2. 25% Н 2 SО 4 - 3 мин 3. Н 2 О 4. Спирт 96% - 5 мин 5. Н 2 О 6. Метиленовый синий 0, 3 % - 1 мин 7. Н 2 О Кислотоустойчивая микобактерия
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-26.jpg" alt="> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная"> МЕТОД ЦИЛЯ-НИЛЬСЕНА 1. На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) 2. Н 2 О 3. 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) 4. Н 2 О 5. Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин 6. Н 2 О 7. Микроскопия с иммерсией. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные – в синий (рис. № 4, 5). Mycobacterium tuberculosis в мокроте
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-27.jpg" alt="> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки. Его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды (пневмококк), но у некоторых они содержат и полипептиды (палочка сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для обнаружения применяют негативную окраску. При этом краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне. ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1: 10. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45 О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой» Сбросить шлифовальное стекло в дез. Средство. Высушить на воздухе Бактериоскопировать.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-28.jpg" alt="> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по"> ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри Высушить на воздухе Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1: 1) – 15 -20 мин Осторожно промыть водой На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3 -5 мин Промыть Н 2 О Высушить на воздухе Микроскопия с иммерсией. Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-29.jpg" alt=">ОКРАСКА ПО БУРРИ И БУРРИ-ГИНСУ Капсула у Klebsiella pneumoniae ">
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-30.jpg" alt="> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается"> МЕТОД ОЖЕШКО сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет. Рис. № 9. Споры у Bacillus subtilis
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-31.jpg" alt="> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько"> ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0, 5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров Высушивают и фиксируют физическим способом Окрашивают по методу Циля-Нильсена: На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза) Н 2 О 5% Н 2 SО 4 (погружая 2 -3 раза) Н 2 О Метиленовый синий 1 % - 3 -5 мин Н 2 О Микроскопия с иммерсией
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-32.jpg" alt="> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при"> Изучение подвижности микроорганизмов. Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков -специальных тонких нитевидных образований.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-33.jpg" alt="> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю"> МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40 Х Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-34.jpg" alt="> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в"> Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0, 2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют: а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас); б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии); в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки; г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E. coli). Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-35.jpg" alt=">Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной"> Определение подвижности бактерий методом «висячая капля» . Каплю молодой (18 -20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые
Src="http://present5.com/presentation/3/55298978_132451894.pdf-img/55298978_132451894.pdf-36.jpg" alt="> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное"> МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина. 1. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. 2. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. Микроскопия сначала при увеличении 8 Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40 Х. Техника приготовления препарата висячая капля
При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.
1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
12. Окраска по Граму, техника, назначение. Отличие грам- и грам+ бактерий.
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.
Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет. Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Отличие грам+ и грам- бактерий
У грамположительных бактерий клеточные стенки содержат мало липидов, а у грамотрицательных клеточные стенки, напротив богаты липидами. И у тех и у других жесткий каркас образуется в результате ковалентного связывания полисахаридных и пептидных цепей. Однако, к этой структурной основе присоединяются некоторые специфические для данной бактерии компоненты, которые у грамположительных и грамотрицательных бактерий имеют разный состав.
Стенки бактериальных клеток содержат еще и некоторые сопутствующие компоненты, которые у разных бактерий варьируются. У грамположительных бактерий это тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды или белки. У грамотрицательных бактерий больше сопутствующих компонентов, вплетенных в муреиновую сеть. Это полипептиды, липопротеины, сложные липополисахариды. Все эти компоненты наделяют клетки грамотрицательных бактерий сложной антигенной специфичностью, а также акцепторной специфичностью по отношению к вирусам.
Таким образом, клеточная стенка грамположительной бактерии представляет собой жесткий хрупкий корпус бактерии, а клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют мягкое покрытие, богатое липидами и укрывающее лежащий под ними муреиновый скелет.
Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями. Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия или бульоном, маленькую каплю размазывают тонким слоем на предметном стекле по площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком. Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии, или этиловым либо метиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.
Большинство красителей, используемых в микробиологии, является солями двух типов. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), является кислотой и при окрашивании более интенсивно связывается с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки, например эозин. У основных красителей роль хромофора играет катион. Будучи основанием, он более интенсивно связывается с ядерными (кислыми) компонентами клетки, например метиленовый синий. Некоторые красители не образуют химических соединений, а просто растворяются или осаждаются на окружающем материале. В механизме окрашивания имеют значение как химические, так и физические процессы.
Для окрашивания бактерий чаще используют основные красители: метиловый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин, тионин. Широко используют щелочной раствор метиленового синего — краситель Леффлера, позволяющий выявить многие детали формы и структуры микробов.
Однако для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование для окрашивания только одного красителя (простой способ окраски) бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания, удовлетворяющие различным требованиям.
Способ окраски по Граму позволяет дифференцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным видам и родам. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течение 1—2 мин, а затем раствором Люголя 1—2 мин. Все микроорганизмы, находящиеся в мазке, приобретают темно-фиолетовый цвет.
После этого мазок обрабатывают 96 % этиловым спиртом в течение 30 с— 1 мин, смывая остатки спирта водой. Под влиянием спирта одни бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолетовую окраску, приданную Им комплексом красителя с йодом. Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а обесцвечивающиеся — грамотрицательными. После дополнительной окраски фуксином последние окрашиваются в красный цвет. Необходимо помнить, что на результаты окраски по Граму часто влияют небольшие отклонения в условиях культивирования или в методике окраски. Старые культуры или отмирающие клетки грамположительных бактерий могут стать грамотрицательными. В кислой среде, как правило, все микробы грамотрицательны. По отношению к окраске по способу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены и др.) и грамотрицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии и др.).
В механизме окраски по Граму имеют значение особенности химического состава микроорганизмов, различия в проницаемости клеточных стенок, наличие рибонуклеата магния у грамположительных бактерий. Между большинством грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют различия в чувствительности к сульфаниламидам, пенициллину и лизоциму.
Способ окраски по Цилю — Нильсену предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов — микобактерий туберкулеза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30—40%) содержанием особых жироподобных веществ (воски). Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или троекратном подогревании до появления паров. Видимо, благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течение 3—5 с; поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет. Остальные микробы обесцвечиваются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими. Для окраски спор, которые при обычных методах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через нее краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков. Споры можно окрасить по методу Циля—Нильсена (споры красные, вегетативное тело синее) или по Ожешко. Для этого на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени. Дальнейшую окраску производят по методу Циля — Нильсена.
Капсулы при обычных методах окраски остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсул микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Например, при окраске метиленовым синим ткани и клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, а вокруг бактерий сохраняется бесцветная зона — капсула. Из специальных методов окраски применяют способ Бурри: на край стекла наносят каплю туши и каплю исследуемого материала, перемешивают их, делают мазок (так же как мазок крови), высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, тела микробов и их капсулы тушью не окрашиваются и остаются бесцветными — негативный способ окраски.
Негативный метод Г и не а сочетает окраску тушью и фуксином. Мазок окрашивают по способу Бурри, затем высушивают, фиксируют спиртом и докрашивают фуксином Циля. Фон препарата черный, капсула не окрашена, бактериальная клетка красная.
Зерна волютина, находящиеся в клетках возбудителей дифтерии, выявляют, применяя окраску по Нейссеру. Этот сложный метод окраски включает несколько этапов: окраску фиксированного на пламени горелки препарата уксуснокислым синим (1—2 мин), затем добавление на мазок нескольких капель раствора Люголя на 1 мин и промывание водой. Препарат докрашивают раствором хризоидина или везувина в течение 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, микробные клетки —в светло-коричневый. Методы окраски жгутиков — осаждение на них танина, который действует как протрава, т. е. способствует фиксации красителя на окрашиваемом объекте (метод Лейфсона).
Для окраски простейших, а также спирохет и риккетсий широко применяют способ Романовского — Гимзы. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением ее растворяют дистиллированной или водопроводной водой (рН 7,0—7,2) из расчета 1: 10. Препарат фиксируют этиловым или хметиловым спиртом в течение 5—15 мин, окрашивают 30—40 мин, высушивают и микроскопируют. Ядро простейших, жгутики и блефа- ропласт окрашиваются в ярко-красный цвет, цитоплазма— в голубой, спирохеты и риккетсии — в сиреневато - синий или розовый.
Присутствие ДНК в клетках микроорганизмов можно определить с помощью реакции Фельгена и ее модификаций. Данный метод основан на способности ядерного материала окрашиваться в темно-пурпурный цвет при обработке реактивом Шиффа, (фуксин, обесцвеченный сернистой кислотой). Предварительно фиксированный мазок обрабатывают горячим (60°С) 1 н. раствором хлористоводородной кислоты в течение 7— 8 мин для разрушения (гидролиз) РНК, наличие которой, особенно в бактериях, затрудняет выявление ДНК. Можно также разрушить РНК специальным ферментом рибонуклеазой, а для окраски использовать красители, предложенные Романовским (азур I—II и эозин).
